功能性肽是指具有某種特定生物活性、對機體有益的肽類化合物，通常由兩個及兩個以上的α-氨基酸組成，廣泛存在于動物、植物以及微生物機體中，可通過蛋白質降解或人工合成得到。按照來源可分為內(nèi)源性功能肽和外源性功能肽，其中源于人體自身的肽稱為內(nèi)源性功能肽，可參與機體代謝；而人體之外的、存在于動植物和微生物中的肽，以及經(jīng)蛋白質降解、氨基酸合成得到的肽則稱為外源性功能肽，具有多種有益健康的生理功能。根據(jù)生物活性可以將功能性肽分為抗氧化肽、抗菌肽、血管緊張素轉化酶抑制肽、抗腫瘤肽、免疫活性肽等。功能性肽分子質量較小、細胞透過性好、易被人體消化吸收，且毒副作用低，從而受到食品、藥品、醫(yī)療等領域的高度關注。

       外源性功能肽的分離純化

       肽可用于功能性食品、藥物（抗癌、抗炎等）和化妝品的開發(fā)等。通過蛋白質降解或氨基酸合成得到的外源性功能肽是由游離氨基酸、不同分子質量的氨基酸組成的肽段、大量無機鹽以及未水解蛋白質等物質組成的混合物。為了獲得具有特定分子質量和氨基酸組成且具有特定功能活性的肽段，必須對混合物進行分離純化。現(xiàn)階段常用的分離純化方法有電泳技術、膜分離技術、色譜技術以及多種方法聯(lián)用等。隨著肽組學的研究深入，又出現(xiàn)了一些新型的分離方法及分離材料，例如介孔材料、探針等。

       01、膜分離技術

       膜分離不同于傳統(tǒng)意義上的過濾，其可以在一定的分子質量范圍內(nèi)進行肽混合物的精準分離，是單純的物理作用，具有操作簡單、不影響樣品活性、適用性強等特點。根據(jù)膜的孔徑大小可以分為微濾膜、超濾膜、納濾膜和反滲透膜等。目前，超濾技術已經(jīng)普遍用于酶解產(chǎn)物的分級分離中。膜分離技術通常作為肽分離純化的第一步，不需化學反應，在常溫條件下進行，過程簡單，適宜大量混合物的分離。但是一定分子質量范圍內(nèi)存在著大量結構相似、質量相近的肽段；除此之外，肽的分離純化容易受到脫鹽的影響，膜材料也容易堵塞和污染，不利于資源的回收與利用。因此，對于肽的分離純化，膜分離技術的選擇性并不高。

       02、電泳技術

       用于肽分離的毛細管電泳有毛細管區(qū)帶電泳、毛細管等速電泳、毛細管等電聚焦、毛細管凝膠電泳、親和毛細管電泳、毛細管免疫電泳、芯片式毛細管電泳、陣列毛細管電泳等。電泳技術具有分辨率高、分離速度快的特點，但是進樣量少、光路短，限制了其在肽分離純化中的大規(guī)模制備及應用。

       03、色譜技術

       色譜技術是最為普遍的肽分離純化方法。常用的色譜技術有大孔樹脂吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、反相高效液相色譜法等。

       大孔樹脂可將吸附和篩選相結合，利用各組分吸附力和分子質量大小不同進行分離。大孔樹脂具有回收率高、選擇性好、分離效率高、吸附條件溫和等特點，廣泛用于色素、多酚、生物活性肽等水溶性化合物的分離提純。

       凝膠過濾層析能夠分離酶解產(chǎn)物中的活性物質，但對于分子尺寸相近的肽，無法進一步純化。凝膠過濾的分離效果易受到基質顆粒的大小及均勻程度的影響，常與其他分離方法（例如超濾等）聯(lián)用才能達到最終分離純化的目的。

       采用一種方式對蛋白質、肽等物質進行分離純化，很難達生物分析的標準。多種方式聯(lián)用可以實現(xiàn)肽混合物的精準分級分離，以獲得高純度的肽組分。如超濾-凝膠過濾色譜-高效液相色譜聯(lián)用，離子交換色譜-凝膠過濾色譜-高效液相色譜聯(lián)用。

       內(nèi)源性功能肽的富集

       通常含有內(nèi)源性功能肽的生物樣品中成分濃度極低（小于1 nmol/L），而且蛋白質和內(nèi)源性功能肽的物理化學性質極其相似。因此，內(nèi)源性功能肽在富集過程中容易受到高含量蛋白及其他復雜成分的影響，選擇性高效富集低濃度內(nèi)源性功能肽成為生物分析的難點問題。按照肽的種類，富集方法可以分為糖肽的富集、磷酸肽的富集以及其他小分子肽的富集。

       01、糖肽的富集

       糖基化是重要的蛋白質翻譯后的修飾之一，人體內(nèi)約有一半以上的蛋白質會發(fā)生糖基化。糖肽的富集方法主要有凝集素親和法、肼化學法、硼酸化學法、親水作用法等。

       凝集素是一種可與多糖結合的蛋白，是最早運用于糖肽富集的物質。常用的凝集素材料有選擇性結合甘露糖的伴刀豆凝集素A、結合N-乙酰神經(jīng)氨酸單元的接骨木凝集素、與巖藻糖相結合的橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素、選擇性識別N-乙酰葡糖胺的小麥胚芽凝集素等。凝集素親和法的缺陷在于它只能與其識別的糖型結合，在選定凝集素的情況下，只有選擇性吸附特定組成的部分糖肽。

       肼化學法富集糖肽的過程包括將糖鏈上的順式鄰二醇氧化成醛；醛基與固相支持物上的酰肼基團共價偶聯(lián)。與凝集素親和法不同，肼化學法可以吸附所有的糖蛋白。

       在堿性溶液中，糖鏈上的順式鄰位和硼酸基團發(fā)生反應形成環(huán)狀二酯，從而進行糖肽的吸附；在酸性溶液中，發(fā)生堿性溶液中的可逆反應，即環(huán)狀二酯水解，從而實現(xiàn)糖肽的解吸。

       02、磷酸肽的富集

       磷酸化肽的富集容易受到高濃度蛋白的影響，磷酸肽的富集方法主要有親和色譜富集法、離子交換色譜法。磷酸肽的親和色譜法富集主要分為金屬氧化物親和色譜法、固定化金屬離子親和色譜法和金屬有機骨架法。離子交換色譜主要依據(jù)磷酸肽和非磷酸肽的電荷差異實現(xiàn)磷酸肽的富集，其中溶液的pH值是影響磷酸肽特異性吸附的重要因素。

       03、其他低濃度度肽的富集

       除了磷酸肽及糖肽，生物體內(nèi)還有多種與生物體代謝及與生理活動密切相關的內(nèi)源性功能肽。納米材料與色譜法聯(lián)用富集內(nèi)源性功能肽，能夠去除復雜成分和高濃度蛋白的影響，并且能定向提取某種肽類。其已經(jīng)成功應用于人血清、小鼠大腦提取物及人體其他體液中內(nèi)源性功能肽的富集，但是納米材料不適用于大量的生物分析，且納米材料也不易與樣品分離，造成目標肽污染。因此，需要研制出更加快速、高效、易于分離的新型納米材料。

       功能性肽可以用于功能性食品開發(fā)、疾病檢測、美容用品研發(fā)等領域，具有極大的開發(fā)利用潛力，成為當前的熱點。功能性肽的深入研究與人類健康息息相關，其分離與富集技術的優(yōu)化能夠促進食品、藥品等行業(yè)的快速發(fā)展，為實現(xiàn)這個目標需要借助其他領域的新材料、新方法，發(fā)展出便捷、高效、覆蓋面廣的分離和富集方法，才能更便捷、更高效地得到功能性肽，為國民健康奠定堅實的基礎。

       參考文獻：

       [1]李欣蔚,廖佳,董秀瑜,周新,楊賀棋,武龍,汪秋寬,周慧.功能性肽的分離及富集研究進展[J].食品科學,2020,41(01):267-276.

       [2]CHALAMAIAH M, YU W L, WU J P. Immunomodulatory and anticancer protein hydrolysates (peptides) from food proteins: a review[J]. Food Chemistry, 2018, 245: 205-222.

       關鍵詞：活性肽  分離純化  富集

       作者簡介：小泥沙，食品科技工作者，畢業(yè)于華南理工大學食品科學與工程學院，食品科學碩士，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事營養(yǎng)食品的開發(fā)與研究。